micro modular

Microsystems & Nanoengineering volume 8, Número do artigo: 82 (2022) Citar este artigo

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A contenção efetiva da pandemia de COVID-19 requer uma detecção rápida e precisa do patógeno. A reação em cadeia da polimerase (PCR) continua sendo o padrão ouro para a confirmação do COVID-19. Neste artigo, relatamos o desempenho de uma plataforma modular econômica de transcrição reversa microfluídica (RT)-PCR e amplificação isotérmica mediada por RT-loop (RT-LAMP), Epidax®, para testes no local de atendimento e confirmação de SARS-CoV-2. Essa plataforma é versátil e pode ser reconfigurada para triagem usando testes endpoint RT-PCR ou RT-LAMP ou para testes confirmatórios usando RT-PCR em tempo real. O Epidax® é altamente sensível e detecta apenas 1 cópia de RNA por µL para RT-PCR em tempo real e endpoint, usando apenas metade dos reagentes. Obtivemos resultados comparáveis ​​aos de uma plataforma comercial ao detectar vírus SARS-CoV-2 a partir de 81 extratos clínicos de RNA. O Epidax® também pode detectar SARS-CoV-2 de 44 amostras nasofaríngeas sem extração de RNA usando um ensaio RT-PCR direto, que reduz o tempo de resposta da amostra para uma hora com etapas mínimas do usuário. Além disso, validamos a tecnologia usando um ensaio RT-LAMP em 54 extratos clínicos de RNA. No geral, nossa plataforma fornece uma solução de diagnóstico sensível, econômica e precisa para configurações de poucos recursos.

Desde o seu surgimento em dezembro de 2019, o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) se espalhou pelo mundo, causando mortes, doenças e perturbações em vidas e negócios.

O controle efetivo da pandemia de COVID-19 requer uma detecção rápida e precisa do vírus. A publicação inicial do genoma do SARS-CoV-2 em janeiro de 2020 permitiu que empresas e laboratórios em todo o mundo desenvolvessem vários ensaios e técnicas para o diagnóstico de COVID-191,2,3. A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) continua sendo o padrão-ouro para a identificação do SARS-CoV-2. Como um programa de testes abrangente provavelmente exigiria triagem amplamente acessível e rápida em combinação com testes de confirmação de PCR altamente sensíveis, há necessidade de métodos alternativos para identificar indivíduos infectados que sejam suficientemente baratos, portáteis e eficazes para permitir um diagnóstico rápido no ponto de uso. Esses testes de ponto de atendimento (POC) são uma ferramenta importante a ser implantada nas fronteiras para abrir viagens e economias internacionais.

Vários testes comerciais baseados em laboratório e POC foram implantados globalmente: Cepheid® Xpert® Xpress SARS-CoV-24, cobas® SARS-CoV-25 da Roche, GenMark ePlex® SARS-CoV-26, teste COVIDNudge da DnaNudge7,8, Abbott ID Agora COVID-199 e outros10. Os três primeiros são sistemas totalmente automatizados para testes de amostras múltiplas com alta sensibilidade, por exemplo, foi relatado que o Xpert® Xpress alcançou 98,3% de sensibilidade em seu teste de PCR de 46 minutos11. No entanto, o equipamento é caro e ocupa um grande espaço, o que restringe os testes de escalabilidade e o uso em ambientes com poucos recursos. COVIDNudge é uma plataforma de RT-PCR sem laboratório que pode detectar sete alvos virais (RdRp1, RdRp2, E-gene, N-gene, N1, N2 e N3) e um controle (Ribonuclease P), com 94% de sensibilidade em um teste de 90 minutos8. No entanto, o número excessivo de poços necessários para uma amostra (72 poços) aumenta a complexidade da operação e torna o teste sujeito a erros de manipulação e interpretação. Os testes POC aprovados pela FDA que empregam amplificação isotérmica, como o Abbott ID Now COVID-19, podem detectar amostras positivas em apenas 5 minutos e resultados negativos em 13 minutos usando um pequeno dispositivo portátil12. Embora essa abordagem possa obter resultados rápidos, há relatos de precisão e sensibilidade limitadas do teste11,13.

O uso de microfluídica para testes de diagnóstico, particularmente em uma configuração POC, é vantajoso porque permite o teste usando uma pequena quantidade de amostra, permitindo potencialmente detecção e implantação mais rápidas com menos reagentes14. Houve inúmeros desenvolvimentos em sistemas de PCR microfluídicos15. Alguns projetos fornecem múltiplas funções no chip para preparação e detecção de amostras. No entanto, esses sistemas não são modulares e ainda apresentam desafios a serem superados para implantação em campo. A maioria dos chips de PCR são feitos de vidro, PDMS ou plástico, que possuem baixa condutividade térmica e não são adequados para aplicações que requerem controle de temperatura rápido e preciso dentro do canal microfluídico16. Para superar essa limitação, os reagentes podem ser movidos para regiões no chip que são pré-aquecidas à temperatura desejada para PCR. Isso foi obtido usando um sistema de fluxo contínuo com várias zonas pré-aquecidas17,18 ou ciclando os reagentes entre as zonas pré-aquecidas16. No entanto, esses métodos requerem bombas de seringa programáveis ​​de alta precisão que tornam o sistema volumoso e inadequado para configurações de POC. Além disso, o aquecimento multizona aumenta a complexidade do chip, o que representa um desafio para a produção em massa. Esse problema é amplificado se várias câmaras de reação (por exemplo, para acomodar controles negativos, positivos e internos) forem necessárias em um chip. A microfluídica também permite o uso de volumes minúsculos, o que reduz o volume de reagentes necessários. Isso é especialmente importante em uma pandemia que interrompe a cadeia de fornecimento de reagentes de teste. Um lab-on-chip microfluídico demonstrou ser capaz de realizar PCR em amostras com volumes na faixa de nanolitros, até 30 nL19,20. Embora um volume pequeno possa reduzir o uso do reagente, um volume muito baixo afetaria adversamente a sensibilidade do teste. Isso é mais pronunciado ao tentar detectar casos assintomáticos nos quais a amostra de entrada tem um título muito baixo de vírus. Esses chips na faixa de nanolitros não podem ser dimensionados para microlitros devido ao design do sistema. Além da PCR, sistemas portáteis de laboratório em chip têm sido usados ​​para realizar amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) para testes de diagnóstico21,22,23,24,25,26. Esses sistemas não podem realizar PCR devido às suas unidades de controle térmico simplificadas. A maioria não pode medir a dinâmica da reação e capturar apenas os resultados finais. Além disso, o RT-LAMP tem sensibilidade menor que o RT-PCR para detecção de COVID-191,11,27,28.