Avaliação de métodos de extração para estudos metabolômicos não direcionados para futuras aplicações em modelos de infecção de larvas de zebrafish

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 7489 (2023) Citar este artigo

315 Acessos

2 Altmétrica

Detalhes das métricas

A preparação de amostras em metabolômica não direcionada deve permitir extrações reprodutíveis do maior número possível de moléculas. Assim, otimizar a preparação da amostra é crucial. Este estudo comparou seis procedimentos de extração diferentes para encontrar o mais adequado para extrair larvas de peixe-zebra no contexto de um modelo de infecção. Duas extrações monofásicas empregando metanol (I) e uma única fase miscível de metanol/acetonitrila/água (II) e dois métodos bifásicos usando separação de fases entre clorofórmio e combinações metanol/água (III e IV) foram testados. A homogeneização adicional do grânulo foi usada para os métodos III e IV (III_B e IV_B). Nove padrões internos e 59 moléculas de interesse (MoInt) relacionadas à infecção micobacteriana foram utilizados para avaliação do método. Os métodos de duas fases (III e IV) levaram a uma menor contagem de recursos, maiores áreas de pico de MoInt, especialmente aminoácidos, e maiores coeficientes de variação em comparação com extrações de uma fase. A adição de homogeneização de grânulos aumentou a contagem de recursos, áreas de pico e CVs. A extração I apresentou áreas de pico maiores e CVs menores do que a extração II, sendo assim o método de uma fase mais adequado. As extrações III e IV apresentaram resultados semelhantes, sendo a III mais fácil de executar e menos propensa a imprecisões. Assim, para aplicações futuras em metabolômica de larvas de peixe-zebra e modelos de infecção, as extrações I e III podem ser escolhidas.

A metabolômica visa analisar analiticamente as alterações de moléculas < 1500 Da (metaboloma) presentes em um organismo ou sistema modelo em um determinado ponto no tempo1,2. O metaboloma inclui metabólitos endógenos, bem como metabólitos originários de fontes exógenas, como drogas. Enquanto as abordagens direcionadas são baseadas na quantificação de metabólitos selecionados, muitas vezes de um determinado grupo de metabólitos, a metabolômica não direcionada visa detectar o maior número possível de metabólitos1,2,3. Técnicas analíticas frequentemente aplicadas para a separação de amostras incluem cromatografia líquida (LC) e cromatografia gasosa, ambas regularmente acopladas à espectrometria de massa1,2,3. A separação LC em abordagens não direcionadas geralmente é feita usando colunas de fase reversa para a separação de metabólitos não polares, colunas de fase normal para a separação de metabólitos polares ou colunas de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) como variações de colunas de fase normal, empregando uma camada de água no topo de sua fase estacionária, resultando em uma separação baseada principalmente na partição líquido-líquido. As colunas Phenyl-Hexyl são colunas de fase reversa com seletividade única para moléculas aromáticas. Após a separação dos metabólitos, eles são ionizados, geralmente usando ionização por eletrospray (ESI) ou ionização à pressão atmosférica e analisados ​​usando um analisador de massa, geralmente Orbitrap ou instrumentos de tempo de voo1,2. Os espectros de fragmentação podem ser gerados na mesma análise usando, por exemplo, aquisição dependente de dados ou independente de dados, ou em uma análise subsequente. Os dados assim gerados podem então ser processados ​​usando métodos de bioinformática, como detecção de pico e pré-processamento, seguidos por estatísticas multivariadas para avaliação e comparação dos espectros de fragmentação com bibliotecas de referência para identificação1,2,3,4,5.

Para entender o efeito de doenças, por exemplo, tuberculose6, e encontrar biomarcadores para um diagnóstico ou sucesso de tratamento, a metabolômica é frequentemente aplicada e a alteração do metaboloma do hospedeiro é observada. Especificamente, as alterações no metaboloma endógeno originárias da infecção por Mycobacterium tuberculosis foram extensivamente estudadas em humanos4,5,6,7 e em modelos animais8, incluindo camundongos, porquinhos-da-índia, coelhos e primatas não humanos9. As alterações induzidas no metaboloma também foram estudadas usando a micobactéria não tuberculosa M. marinum em larvas de zebrafish (Danio rerio, ZF) como um de seus hospedeiros naturais10. Esse modelo ZF usando M. marinum se assemelha a estruturas semelhantes a granulomas, normalmente encontradas em sua contraparte mamífera11,12,13,14. O genoma da ZF é cerca de 70% idêntico ao humano15 e em vários estudos foi relatado um metabolismo semelhante ao humano, tanto no que diz respeito ao metabolismo xenobiótico16,17,18,19 quanto ao metaboloma do hospedeiro em caso de infecção20,21. O modelo de larva ZF apresenta outras vantagens, que incluem facilidade de manuseio, transparência óptica de embriões e larvas e menor custo monetário, em comparação com outros organismos22,23. Além disso, experimentos realizados com embriões e larvas com menos de 120 h pós-fertilização (hpf) não são considerados experimentos com animais na União Europeia (diretiva da UE, 2010/63/EU)24. Devido às inúmeras vantagens, os estudos de ZF empregando metabolômica não direcionada são hoje em dia cada vez mais comuns25,26, mas raramente usados ​​no contexto de doenças e M. marinum em particular20.